Có thể nói một điều rằng kính hiển vi tương phản pha đã mở ra một thế giới mới trong lĩnh vực quan sát hiển vi.
Trước khi kỹ thuật quan sát tương phản pha - phase contrast được tìm ra thì các nhà khoa học bị giới hạn trong quan sát trường sáng và không thể nhìn thấy các vi sinh vật sống.
Ngày nay, quan sát tương phản pha đã trở thành một đặc tính tiêu chuẩn ở hầu hết kính hiển vi hiện đại.
Lịch sử và nền tảng
Frits Zernike, một nhà vật lý và toán học người Hà Lan, đã chế tạo kính hiển vi tương phản pha đầu tiên vào năm 1938.
Cần phải mất một thời gian cộng đồng khoa học mới công nhận được tiềm năng từ phát minh của Zernike; ông đã đoạt giải Nobel vào năm 1953.
Zernike đã làm thí nghiệm với tốc độ của đường truyền sáng trực tiếp trên mẫu. Ông đã tìm ra phương pháp can thiệp khiến cho hình ảnh sáng hơn hoặc tối hơn.
Ông đã phát triển một hệ thống vòng annuli đặt trong ống kính và bên dưới tụ quang để can thiệp vào ánh sáng. Zernike điều khiển vòng và nguồn sáng, làm giảm bước sóng ánh sáng 1/2 pha. Ứng với mỗi một độ phóng đại, 10X hoặc 100X, cần các vòng tương ứng.
Chất lượng quan sát, đặc biệt là độ tương phản và phân giải của mẫu (P) phụ thuộc vào mối quan hệ giữa vòm sóng (S) và nhiễu xạ mặt sóng hình cầu (D). Phương trình cơ bản của tương phản pha ở đây là P =S+D.
Từ đó Zernike có thể tách riêng bậc thứ không (S) khỏi ánh sáng nhiễu xạ (D) làm tăng độ rõ của hình ảnh (P).
Tóm lại, phương pháp tiếp cận và điều chỉnh sự chiếu sáng của Zernike đã thay đổi cách chúng ta sử dụng kính hiển vi và quan sát mẫu.
Đối tượng tương phản
Tương phản pha rất hữu ích trong quan sát các mẫu không màu, trong suốt hoặc không nhuộm hay còn gọi là các đối tượng tương phản.
Bởi vì các đối tượng này không hấp thu ánh sáng nên không thể quan sát chi tiết.
Kính hiển vi tương phản pha sẽ lợi dụng cả ánh sáng trực tiếp và ánh sáng nhiễu xạ để làm tăng chất lượng và độ rõ của các mẫu trong suốt.
Quan trọng nhất là rất nhiều các đối tượng tương phản là các mẫu sinh học sống, do đó tiềm năng về sử dụng cũng như ý nghĩa của kính hiển vi tương phản pha trong thế giới quan sát hiển vi là không thể xem thường.
Có hai loại kính hiển vi tương phản pha chính là phản pha dương và phản pha âm. Bởi vì mẫu quan sát thường mỏng và trong suốt nên hai loại tương phản đối nhau này sẽ cho ra hình ảnh rất khác nhau.
- Tương phản pha dương : sẽ cho hình ảnh của mẫu có màu xám tối trên một nền màu xám sáng. Hình ảnh sẽ có một đường sáng chạy dọc theo rìa của mẫu.
- Tương phản pha âm : thì ngược lại. Mẫu sẽ có màu sáng hơn với nền màu đen; cũng có một đường tối chạy dọc theo rìa ngoài của mẫu.
Ứng dụng trong quan sát hiển vi
Kính hiển vi tương phản pha có thể sử dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử và sinh học tế bào, vi sinh và nghiên cứu về y khoa.
Mẫu có thể được quan sát và nghiên cứu bao gồm các vi sinh vật sống như protozoa, hồng cầu, vi khuẩn, nấm mốc và tinh trùng, sợi, mảnh thủy tinh và các hạt dưới mức tế bào như nhân và các bào quan.