Mẫu vật được chiếu sáng bằng ánh sáng của một bước sóng đặc biệt (hoặc nhiều bước sóng) được hấp thụ bởi các chất huỳnh quang , khiến chúng phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn (ví dụ, màu sắc khác hơn so với ánh sáng hấp thụ). Ánh sáng chiếu sáng được tách ra từ huỳnh quang phát ra yếu hơn nhiều thông qua việc sử dụng một bộ lọc quang phổ. Bộ phận quan trọng của kính hiển vi huỳnh quang là nguồn ánh sáng ( phổ biến là đèn hồ quang xenon hay đèn hơi thủy ngân, hoặc cao cấp hơn là đèn năng lượng cao LED và laser ), các bộ lọc kích thích , các gương lưỡng sắc (hoặc bộ tách chùm lưỡng sắc ), và bộ lọc phát xạ (xem hình bên dưới). Các bộ lọc và gương lưỡng sắc được lựa chọn để phù hợp với đặc điểm quang phổ kích thích và phát xạ của chất huỳnh quang được sử dụng để đánh dấu mẫu vật. Theo cách này, sự phân bố của một huỳnh quang duy nhất (màu sắc) được chụp ảnh tại một thời điểm. Hình ảnh nhiều màu sắc của một số loại huỳnh quang được tạo ra bằng cách kết hợp một số hình ảnh đơn màu.
Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất là kính hiển vi epifluorescence, trong đó sự kích thích của chất huỳnh quang và dò tìm ánh sáng huỳnh quang được thực hiện thông qua cùng một đường truyền sáng (tức là thông qua vật kính). Loại kính hiển vi huỳnh quang này được sử dụng rộng rãi trong sinh học và là cơ sở cho nhiều mẫu thiết kế kính hiển vi tiên tiến, chẳng hạn như kính hiển vi đồng tiêu và kính hiển vi huỳnh quang phản chiếu tổng số nội bộ (TIRF).
 |
| Cấu tạo kính hiển vi huỳnh quang |
Phần lớn các kính hiển vi huỳnh quang, đặc biệt là những loại sử dụng trong khoa học sự sống , dựa trên thiết kế epifluorescence. Ánh sáng của các bước sóng kích thích tập trung vào các mẫu thông qua các vật kính. Ánh sáng huỳnh quang phát ra từ mẫu vật được tập trung vào bộ dò tìm bởi cùng vật kính sử dụng cho ánh sáng kích thích cho độ nhạy lớn nhất sẽ có một số khẩu độ rất cao. Vì hầu hết các ánh sáng kích thích được truyền qua mẫu vật, chỉ có ánh sáng phản xạ kích thích đến được vật kính cùng với ánh sáng phát ra, do đó phương pháp epifluorescence cho ra tỷ số tín hiệu trên độ nhiễu cao. Thêm bộ lọc chắn giữa các vật kính và bộ dò tìm có thể lọc ra ánh sáng kích thích còn lại từ ánh sáng huỳnh quang.
Nguồn sáng
Kính hiển vi huỳnh quang đòi hỏi ánh sáng cường độ cao, gần như đơn sắc mà một số nguồn sáng phổ biến, như đèn halogen không thể đáp ứng được. Bốn loại nguồn sáng chính được sử dụng, bao gồm đèn hồ quang xenon hoặc đèn hơi thủy ngân với một bộ lọc kích thích ,laser , nguồn supercontinuum , và đèn LED năng lượng cao. Laser được sử dụng rộng rãi nhất cho kỹ thuật hiển vi huỳnh quang phức tạp hơn như kính hiển vi đồng tiêu và kính hiển vi huỳnh quang tổng số phản xạ nội bộ trong khi đèn xenon, đèn thủy ngân và đèn LED với một bộ lọc lưỡng sắc thường được sử dụng cho kính hiển vi epifluorescence.
Chuẩn bị mẫu
 |
| Một mẫu tinh trùng cá trích màu với được nhuộm với SYBR màu xanh lá trong một cuvette được chiếu sáng bởi ánh sáng màu xanh lục trong một kính hiển vi epifluorescence. Chất nhuộm SYBR xanh lá trong mẫu liên kết với DNA tinh trùng cá trích, và một khi gắn vào, sẽ phát huỳnh quang tỏa ra ánh sáng màu xanh lá cây khi được chiếu sáng bởi ánh sáng màu xanh lục. |
Cách thức hoạt động
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn thủy ngân hoặc đèn xenon để tạo ra ánh sáng cực tím. Ánh sáng này đi vào kính hiển vi huỳnh quang chạm vào gương lưỡng sắc - một tấm gương phản xạ một dải bước sóng này và cho phép một dải bước sóng khác đi qua. Gương lưỡng sắc phản chiếu ánh sáng cực tím đến mẫu vật. Ánh sáng cực tím kích thích sự phát huỳnh quang từ các phân tử trong mẫu vật. Vật kính thu nhận ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra. Ánh sáng huỳnh quang này đi qua gương lưỡng sắc và một bộ lọc chắn (loại bỏ các bước sóng không phải huỳnh quang), và cuối cùng vào thị kính để tạo thành hình ảnh.
 |
| Sơ đồ kính hiển vi huỳnh quang |
 |
| Hình ảnh huỳnh quang của các tế bào não chuột nuôi. Các tế bào sống với vết calcein (trên) và các tế bào chết với vết Propidium iodide (bên dưới) |
 |
| Hình ảnh huỳnh quang của các tế bào não chuột nuôi. Các tế bào sống với vết calcein (bên trên) và các tế bào chết với vết Propidium iodide (bên dưới) |
Kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang rất hữu dụng để quan sát cấu trúc và đo lường hoạt động sinh lý và sinh hóa trong tế bào sống. Các chỉ thị huỳnh quang khác nhau luôn có sẵn để nghiên cứu nhiều hợp chất sinh lý quan trọng như DNA, canxi, magiê, natri, pH và các enzym. Ngoài ra, các kháng thể đặc hiệu cho các phân tử sinh học khác nhau có thể gắn kết hóa học với các phân tử huỳnh quang và được sử dụng để nhuộm các cấu trúc cụ thể trong các tế bào.
Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi huỳnh quang
Trong kính hiển vi huỳnh quang , fluorophore được sử dụng để phản xạ hình ảnh của một mẫu nhất định. Một kính hiển vi huỳnh quang thường được cấu thành từ một nguồn ánh sáng chuyên dụng như thủy ngân hoặc Xenon, bộ lọc kích thích, bộ lọc phát xạ và gương lưỡng sắc . Các bước sau đây sẽ hướng dẫn bạn cách sử dụng một kính hiển vi huỳnh quang đúng cách và an toàn.
Bước 1: Gỡ phần bảo vệ bên ngoài của kính hiển vi huỳnh quang. Hãy chắc chắn rằng nó được thiết lập ở độ phóng đại thấp trước khi cắm vào nguồn và bật công tắc. Bật đèn thủy ngân. Bạn sẽ phải chờ khoảng mười lăm phút để kính hiển vi có thể cung cấp độ sáng đầy đủ . Chuyển đổi trên hộp tập trung cơ giới.
Bước 2: Đặt slide đúng cách trên bàn mang mẫu. Giữ các slide bằng kẹp. Nhìn qua thị kính và từ từ thực hiện những điều chỉnh cần thiết để tập trung hình ảnh của mẫu. Các núm chỉnh thô để nâng hoặc hạ thấp bàn mang mẫu trong khi các núm chỉnh tinh dùng để cung cấp một hình ảnh sắc nét và rõ ràng hơn về mẫu vật của bạn.
Nếu bạn chuyển sang một vật kính khác , bạn phải xoay phần cổ của mâm mang vật kính trên kính hiển vi huỳnh quang của bạn. Không được tác động lên các ống kính vật kính vì điều này có thể làm hỏng sự sắp xếp bên trong vật kính.
Việc thay đổi bộ lọc được thực hiện tốt nhất khi kính hiển vi đang ở độ phóng đại thấp. Không được điều chỉnh các núm trên bàn mang mẫu, nếu bạn đang định điều chỉnh tụ quang cho đèn chiếu sáng Kohler.
Bước 3: Nếu bạn quan tâm đến việc chụp ảnh của mẫu, bạn có thể gắn một thị kính máy ảnh với kính hiển vi. Hình ảnh sẽ được lưu trữ trên bộ nhớ trong máy ảnh của bạn hoặc trên một thiết bị lưu trữ được kết nối.
Bước 4: Nếu bạn đã hoàn thành việc sử dụng kính hiển vi, bạn chỉ có thể tắt kính hiển vi nếu bạn đã sử dụng ít nhất ba mươi phút. Sau đó gỡ bỏ các slide từ kính hiển vi, tắt hộp điều khiển tập trung. Tắt đèn thủy ngân. Bạn có thể bật kính hiển vi huỳnh quang một lần nữa sau nửa giờ .
Bước 5: Tháo kính hiển vi huỳnh quang và đặt lại vị trí ban đầu của nó và bọc lớp bảo vệ bên ngoài.
 |
| Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang đúng cách, đảm bảo an toàn cho bản thân |
Những lưu ý khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang
Đèn thủy ngân có thể phát ra bức xạ tia cực tím rất mạnh và có thể nhìn thấy, vì thế cần tránh nhìn trực tiếp . Không tháo rời khoang đèn . Không nhìn vào thị kính của kính hiển vi huỳnh quang khi bạn đang thay đổi bộ lọc. Một số bộ lọc có thể phản xạ các tia UV trực tiếp vào mắt của bạn .
Luôn luôn ghi lại bao nhiêu giờ bạn đã sử dụng đèn thủy ngân của kính hiển vi huỳnh quang. Vượt quá tuổi thọ dự kiến của nó có thể làm cho kính hiển vi huỳnh quang của bạn có nguy cơ phát nổ.
Bật và tắt đèn thủy ngân thường xuyên có thể làm giảm tuổi thọ của nó. Hãy để đèn bật nếu có người khác sẽ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang trong thời gian hai giờ .
Nếu bạn đang sử dụng các vật kính soi dầu cho kính hiển vi huỳnh quang của bạn, hãy cẩn thận khi bạn đang sử dụng các vật kính độ phóng đại thấp . Dầu từ slide của bạn có thể làm dơ các vật kính của bạn khi bạn xoay mâm mang vật kính của kính hiển vi không đúng cách. Sau khi sử dụng, bạn có thể làm sạch ống kính bằng giấy lau kính, chấm nhẹ để thấm dầu. Không lau mạnh tay.